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牛昱宇/季维智团队首次在灵长类动物中证实碱基编辑存在大范围RNA脱靶
发布时间:2022/8/1 17:45:17
 
单碱基编辑器(Base Editor)是治疗由点突变产生的遗传性疾病最有效和精确的方法,由于能够在不依赖DNA双链断裂(DSB)的情况下实现对单个碱基的定向修改,单碱基编辑器能够最大限度的减少基因编辑中不良产物的产生。
然而单碱基编辑器依然存在一定的脱靶效应,并由此带来潜在的安全性问题。由于个体单核苷酸多态性(SNP)的存在,单碱基编辑器的脱靶效应的评估依赖于高灵敏度的检测技术,同时需要有严格的对照样本,才能够从全基因组测序数据中识别出非sgRNA依赖的脱靶突变。2019年,Science 杂志上发表的两篇论文分别用不同的方法在水稻(来自高彩霞团队)和小鼠(来自杨辉团队)上证明了单碱基编辑系统存在严重的脱靶效应
由于灵长类动物在遗传和生理上与人类高度相似,在应用于临床之前,基因编辑工具在灵长类动物个体水平的效率和安全性评估显得尤为重要。

2022年7月22日,昆明理工大学灵长类转化医学研究院牛昱宇教授/季维智院士课题组在 Science Advances 期刊在线发表了题为:Cloning and base-editing of GFP transgenic rhesus monkey and off-target analysis 的研究论文。
该研究基于体细胞核移植(SCNT)技术,建立了一种适用于灵长类动物的单碱基编辑器脱靶检测方法——OA-SCNT,并利用该方法对腺嘌呤单碱基编辑器ABEmax在猕猴胚胎DNA、RNA水平的脱靶效应进行了系统评估。
在该研究中,研究团队以一只表达绿色荧光蛋白(GFP)的成年转基因猕猴的体细胞核作为供体,采用SCNT方法构建克隆胚胎。在胚胎早期阶段利用单碱基编辑沉默GFP表达,并通过胚胎移植得到克隆猴。由于细胞核来自同一只动物,编辑组和对照组胚胎的基因背景完全一致,通过比对两者之间的差异便可鉴定出由基因编辑工具造成的突变。

OA-SCNT方法示意图

研究团队收集了包含克隆胚胎和克隆猴成体组织在内的样本进行全基因组和转录组测序,进而完成DNA和RNA水平的脱靶分析。在DNA水平,无论是SNV总数还是特异的A>G和T>C突变数量,编辑组与对照组均没有显著差异,说明ABEmax系统并没有引起明显的DNA脱靶编辑,这一点与小鼠胚胎的结果类似。而RNA脱靶分析结果则显示,在编辑组的猕猴胚胎中出现了显著增加的SNVs,且绝大多数为A > G和T > C突变,表明ABEmax会引起大规模的RNA脱靶编辑
在基因表达总体水平相当的情况下,脱靶突变更多发生在表达量相对较高的基因,并且随机分布在不同的转录本中。此外,分析数据表明,98%以上的脱靶突变发生在蛋白编码序列,仅1.9%为长链非编码RNA(lncRNAs)。研究者进一步评估了RNA脱靶突变的基因与胚胎早期发育关键基因的关系,发现每个胚胎中平均有392个脱靶编辑位点发生在与胚胎早期发育相关的基因,但对基因表达量没有影响。此外,每个编辑组胚胎样本中平均有109个脱靶编辑位点与致癌基因或抑癌基因相关,同样,这些基因的表达量与对照组相比没有显著变化,但其蛋白编码序列有可能被改变。

                                                                                                                    供体猴及克隆猴照片

综上,该研究首次成功实现了成年转基因猕猴的克隆和单碱基编辑,并以此为基础建立了灵长类动物单碱基编辑脱靶分析方法,首次实现了灵长类个体水平的单碱基编辑脱靶效应评估,将为精准基因编辑工具的开发和优化提供重要数据


来源:生物世界

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